Maillard reaction of Proteins

บทนำ

     Maillard reaction : คำจำกัดความและเคมีวิทยา

        ค.ศ. 1912 Louiis Maillard นักเคมีชาวฝรั่งเศส เป็นคนแรหที่อธิบายเกี่ยวกับปรากฏการณ์การเกิดสีน้ำตาลหลังจากใหความร้อนกับสารละลายผสมของ glucose กับ glycine ผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้นจากปฏิกิริยานี้เรียกว่า Maillard reaction product (MRP) ซึ่งมีลักษณะเป็น sugar-amine  compound ตั้งแต่นั้นเป็นต้นมาก็ได้มีการศึกษาเกี่ยวกับ Maillard reaction มากมาย ในส่วนที่เกี่ยวข้องกับวิทยาศาสตร์สุขภาพ 2 ประเด็น คือ Maillard reaction เกิดขึ้นนระหว่างการผลิตอาหารซึ่งจะมีผลต่อคุณภาพทางโภชนาการ ซึ่งทำให้สูญเสียสารอาหารบางชนิดไปและอาจทำให้เกิดกลิ่นหรือรสชาติเปลี่ยนไป สิ่งที่สำคัญมากในประเด็นนี้คือการที่เกิด glucose-amine compound ทำให้สูญเสีย sugar และ amino acid อาจมีผลต่อการดูดซึม และ metabolism สารอาหารบางชนิด ประเด็นที่สอง Maillard reaction เกี่ยวข้องกับ tissue-aging process พบว่ามีความสัมพันธ์ระหว่างเวลาและโปรตีน เซลล์ และเนื้อเยื่อ เช่น ผู้ป่วยเบาหวาน จะมี fructose สูงในเนื้อเยื่อ เช่น lens ทำให้เกิด cataract ได้        

       ปฏิกิริยาเมลลาร์ด (Maillard reaction) เป็นปฏิกิริยาการเกิดสีน้ำตาล (browning reaction) ชนิดที่ไม่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์ (non enzymatic browning reaction) เกิดขึ้นระหว่างน้ำตาลรีดิวส์ (reducing sugar) กับกรดแอมิโน โปรตีน หรือสารประกอบไนโตรเจนอื่นๆ โดยมีความร้อนเร่งปฏิกิริยา ผลิตผลที่ได้จากปฏิกิริยาเมลลาร์ด เป็นสารประกอบหลายชนิด ที่ให้สีน้ำตาลและกลิ่นรสต่างๆ ทั้งที่พึงประสงค์ และไม่พึงประสงค์ เช่น สีน้ำตาลที่เกิดขึ้นระหว่างการอบ การทอดเ ช่น เนื้อสัตว์ เบเกอรี่ (bakery) ปฏิกิริยานี้ยังมีความสำคัญต่อการเกิดสีและกลิ่นหอมที่ได้จาก การคั่วเมล็ดกาแฟ โกโก้ การทำคาราเมล ทอฟฟี่ ช็อคโกแลต น้ำปลา ซีอิ๊ว (fermented soy sauce) เป็นต้น

ขั้นตอนการเกิดปฏิกิริยาเมลลาร์ด

1.  น้ำตาลรีดิวซิง (reducing sugar) ทั้งน้ำตาลคีโทส (ketose) เช่น ฟรักโทส (fructose) และแอลโดส (aldose) เช่น กลูโคส (glucose) จะรวมตัวกับหมู่แอมิโน (RNH₂) ของ กรดแอมิโน ได้เป็นไกลโคซิลเอมีน

2.  เกิดปฏิกิริยาดีไฮเดรชันได้เป็นอิมีน (imines หรือ Schiff 's base) และมีการเรียงตัวใหม่ซึ่งมีชื่อเรียกว่า Amadori rearrangement ได้เป็นแอลโดสเอมีน (aldoseamine) หรือ คีโทสเอมีน (ketoseamine) เรียกว่า Amadori compound เช่น 1-อะมิโน-1-ดีออกซี-คีโทส ซึ่งจะเกิดปฏิกิริยาต่อเนื่องได้ เมื่อมีค่าพีเอช 5 หรือต่ำกว่า

 3.  เกิดปฏิกิริยา enolization ของ Amadori compounds ได้เป็นไดคีโทสเอมีนหรือไดแอมิโนชูการ์ เช่น         3- ดีออกซีเฮกโซซูโลส

4.  เกิดปฏิกิริยาดีไฮเดรชันต่อได้เป็นอนุพันธ์ของฟูแรน (furan) ถ้าเป็นน้ำตาลเฮกโซส อนุพันธ์ฟูแรน คือ    5-ไฮดรอกซีเมทิล-2-เฟอรัลดีไฮด์ (5-hydroxymethyl-2-furaldehyde หรือ HMF)

 5.  อนุพันธ์ฟูแรนวงแหวน เช่น HMF จะเกิดพอลิเมอไรซ์อย่างรวดเร็วได้เป็นสารสีน้ำตาลที่มีไนโตรเจนเป็นองค์ประกอบอยู่ด้วยและไม่ละลายในน้ำ ซึ่งต่างจากการเกิดคาราเมไลเซชัน (caramelization) ซึ่งมีสีน้ำตาลเพียงอย่างเดียว สารสีน้ำตาลที่เกิดขึ้นนี้จึงเรียกว่า เมลานอยดิน (melanoidins) ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นเป็นปฏิกิริยาโมลต่อโมล (mole per mole reaction)

วัตถุประสงค์

       เพื่อประเมินผลด้านสีและกลิ่นของกรดอะมิโนและสารละลายกลูโคสหลังให้ความร้อน

อุปกรณ์และสารเคมี

     1.       Glucose                                          7.       Arginine

     2.       Lysine                                             8.       Cystine

     3.       Phenylalanine                                 9.       tyrosine

     4.       Methionine                                     10.   หลอดทดลอง

     5.       Leucine                                           11.   Water bath

     6.       Proline                                            

    

วิธีการทดลอง

1.       ใส่ glucose ลงในหลอดทดลองแปดหลอด หลอดละ 200 mg

2.       ใส่ amino acid ทั้งแปดชนิดในหลอดทดลอง หลอดละชนิด 200 mg

3.       ใส่น้ำกลั่น 2 ml ลงในหลอดแล้วเขย่าให้เข้ากัน

4.       ปิดฝาหลอดทดลองนำไปใส่ใน water bath ที่อุณหภูมิ 100 องศา เป็นเวลา 45 นาที

5.       ทำให้เย็นลง

6.       สังเกตสีและดมกลิ่น

ตารางบันทึกผลการทดลอง

Test tube No.	Sample	Oder	Color
1	Glucose + Lysine	กลิ่นหอมอ่อนๆ	เหลืองอ่อน
2	Glucose + Phenylalanine	กลิ่นกุหลาบ	ใสมีตะกอน
3	Glucose + Methionine	กลิ่นเหม็นหืน	เป็นวุ้นใส
4	Glucose + Leucine	กลิ่นอับชื้น	เป็นวุ้นใส
5	Glucose + Proline	กลิ่นใบเตย
6	Glucose + Arginine	กลิ่นถุงเท้า	น้ำตาลดำ
7	Glucose + Cystine	กลิ่นเหม็นเขียว	ใสมีตะกอน
8	Glucose + tyrosine	กลิ่นกรดอ่อนๆ	ขาวขุ่น

อ้างอิง : http://www.med.cmu.ac.th/dept/nutrition/DATA/common/mailard%20reaction%20-%20PN.pdf       
http://www.foodnetworksolution.com/wiki/word/0397/maillard-reaction-%E0%B8%9B%E0%B8%8F%E0%B8%B4%E0%B8%81%E0%B8%B4%E0%B8%A3%E0%B8%B4%E0%B8%A2%E0%B8%B2%E0%B9%80%E0%B8%A1%E0%B8%A5%E0%B8%A5%E0%B8%B2%E0%B8%A3%E0%B9%8C%E0%B8%94

การวิเคราะห์หาปริมาณวิตามินซี

จุดประสงค์

       เพื่อให้นักศึกษาฝึกทักษะในการวิเคราะห์หาปริมาณวิตามินซีในอาหารและทราบถึงผลของความร้อนที่มีต่อวิตามินซี

ตัวอย่างอาหาร : น้ำสับปะรด

อุปกรณ์

     1.       Volumetric flask ขนาด 100 ml

     2.       Erlenmeyer flask ขนาด 125 ml

     3.       Burette ขนาด 50 ml

     4.       Pipette ขนาด 2, 10  ml

     5.       Beaker ขนาด 100 และ 250 ml

     6.       Glass funnel

     7.       Cylinder ขนาด 100 ml

     8.       เครื่องปั่นไฟฟ้า, โกร่ง

     9.       Watch glass

     10.   Dropper

สารเคมี

     1.       0.4% (w/v) Oxalic acid เตรียมโดยละลาย Oxalic acid 4 กรัมในน้ำกลั่น แล้วปรับปริมาตรให้เป็น 1 ลิตร

     2.       2,6-dichlorophenollindophenol 0.05% (w/v) เตรียมโดยละลายเกลือโซเดียมของ 2,6-dichlorophenollindophenol 0.25 กรัม ในน้ำกลั่นอุ่น 100 ml ปรับปริมาตรให้เป็น 500 ml กรองใส่ขวดสีชา เก็บในตู้เย็นได้นาน 2-3 สัปดาห์ (ก่อนชุ้ทกครั้งควรไตเตรทเทียบกับปริมาณวิตามินซีมาตรฐาน)

     3.       Standard Vitamin C 0.1% (w/v) เตรียมโดยละลาย ascorbic acid 0.1 กรัมใน 0.4% (w/v) Oxalic acid 100 ml (1ml = 1 mg ascorbic acid)

วิธีการทดลอง

     1.Standard dization of dye

ปิเปตสารละลายวิตามินซีมาตรฐานมา 2 ml ใส่ลงในขวดรูปชมพู่ ไตเตรทกับสารละลาย 2,6-dichlorophenollindophenol ((DIP) จนเกิดสีชมพูปรากฏนาน 15 วินาที จดปริมาตรของสารละลาย DIP ที่ใช้

ตารางที่ 1 Standard dization of dye

ครั้งที่	ปริมาตร DIP เริ่มต้น (ml)	ปริมาตร DIP สุดท้าย (ml)	ปริมาตร DIP ที่ใช้ไตเตรท (ml)
1	15.00	22.00	7.00
2	22.00	29.10	7.10
3	29.10	36.70	7.60
ปริมาตร DIP ที่ใช้ไตเตรทเฉลี่ย :			7.23

คำนวณ

7.23 ml DIP  ทำปฏิกิริยาพอดีกับวิตามินซี 2 mg

1 ml DIP ทำปฏิกิริยาพอดีกับวิตามินซี (1*2)/7.23  = 0.28 mg

     2.       ผลของความร้อนที่มีต่อปริมาณวิตามินซีในน้ำผลไม้

ตอนที่ 1 ปริมาณวิตามินซีในผลไม้สด

1.       นำผลไม้ตัวอย่างมาคั้นน้ำ

2.       ปิเปตน้ำผลไม้ตัวอย่างมา 50 ml ใส่ลงในขวดปรับปริมาตรขนาด 100 ml จำนวน 3 ขวด ปิดปากขวดด้วยกระดาษฟอยล์

3.       นำไปแช่ใน water bath ที่อุณหภูมิ 100 องศา เป็นระยะเวลา 0,30 และ 60 นาที

4.       นำออกจาก water bath จากนั้นปรับปริมาตรให้ครบ 100 ml ด้วย 0.4% Oxalic acid

5.       ปิเปตน้ำผลไม้ที่ได้มา 10 ml ใส่ลงในขวดรูปชมพู่ ขนาด 125 ml จำนวน 3 ขวด

6.       ไตเตรทด้วยสารละลาย 2,6-dichlorophenollindophenol จนเกิดสีชมพูปรากฏนาน 15 วินาที

7.       บันทึกปริมาตรสารละลาย 2,6-dichlorophenollindophenol ที่ใช้ แล้วนำมาคำนวณหาปริมาณวิตามินซี ในน้ำผลไม้เป็นมิลลิกรัมต่อ 100 ml ของน้ำผลไม้

8.       เขียนกราฟแสดงความสัมพันธ์ของปริมาณวิตามินซีในผักผลไม้กับระยะเวลาที่ใช้ในการต้ม

ตารางที่ 2 ปริมาณวิตามินซีในน้ำผลไม้

ตัวอย่าง : น้ำสับปะรด

ระยะที่ให้ความร้อน (นาที)	ครั้งที่	ปริมาตร DIP เริ่มต้น (ml)	ปริมาตร DIP สุดท้าย (ml)	ปริมาตร DIP ที่ใช้ ไตเตรท(ml)
0	1	15.00	22.00	7.00
	2	22.00	29.30	7.30
	3	29.30	36.50	7.20
	เฉลี่ย	22.10	29.27	7.17
30	1	36.50	41.50	5.00
	2	5.00	10.00	5.00
	3	10.00	15.00	5.00
	เฉลี่ย	17.17	22.17	5.00
60	1	23.00	27.30	4.30
	2	27.30	31.90	4.60
	3	31.90	36.60	4.70
	เฉลี่ย	27.40	31.93	4.53

คำนวณ

ที่ 0 นาที        1.00 ml DIP มีค่าประมาณ  0.28 mg vitamin C

                      7.17 ml DIP มีค่าประมาณ (7.17*0.28)/1  = 2.01 mg vitamin C

ที่ 30 นาที       1.00 ml DIP มีค่าประมาณ 0.28 mg vitamin C

                       5.00 ml DIP มีค่าประมาณ (5.00*0.28)/1  = 1.40 mg vitamin C

ที่ 60 นาที       1.00 ml DIP มีค่าประมาณ 0.28 mg vitamin C

                      4.53 ml DIP มีค่าประมาณ (4.53*0.28)/1  = 1.27 mg vitamin C

สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง

        การวิเคราะห์วิตามินซีในน้ำสับปะรด เมื่อให้ความร้อนที่  100 องศา ในเวลาต่างกัน พบว่า เมื่อให้ความร้อนในเวลาที่นานขึ้น จะทำให้ปริมาณวิตามินซีในน้ำสับปะรดลดลงเรื่อยๆ ดังนั้นความร้อนจะทำให้เกิดการสูญเสียวิตามินซีในอาหารได้ซึ่งสูญเสียมากหรือน้อยขึ้นอยู่กับอุณหภูมิที่ให้ความร้อนและระยะเวลาที่ให้ความร้อน

       การวิเคราะห์วิตามินซีด้วยวิธีนี้สังเกตจุดยุติได้ยาก เนื่องจากสีจะเกิดขึ้นไม่ชัดเจน และเมื่อตั้งทิ้งไว้สักพักสีก็จางลง