บทนำ
การทดสอบคุณสมบัติของโปรตีน สามารถทำได้โดยดูปฏิกิริยาการเกิดสีของโปรตีนกับรีเอเจนต์ชนิดต่างๆ
ซึ่งโปรตีนแต่ละชนิดอาจให้สีหรือไม่ให้สีกับรีเอเจนต์ที่ใช้ทดสอบ
ทั้งนี้ขึ้นกับหมู่เฉพาะที่อยู่ในโปรตีนชนิดนั้นๆ
ปฏิกิริยาการให้สีของโปรตีนมีอยู่หลายปฏิกิริยาที่สำคัญด้วยกันคือ
1.
ปฏิกิริยาไบยูเรต
อาศัยหลักว่าสารที่ประกอบด้วยพันธะเปปไทด์ตั้งแต่สองแห่งขึ้นไป
เมื่อทำปฏิกิริยากับไบยูเรตรีเอเจนต์ (สารละลายทองแดงซัลเฟตในด่าง)
จะให้สีม่วงจนถึงสีชมพูขึ้นกับขนาดของโมเลกุลของโปรตีน
ทั้งนี้เปปไทด์ที่มีโมเลกุลเล็กๆและกรดอะมิโนจะไม่ให้สี
2.
ปฏิกิริยานินไฮดริน เป็นปฏิกิริยาการทดสอบโปรตีน
และกรดอะมิโนที่มีอย่างน้อย 1 free amine group และ 1 free COOH ในสารละลายที่เป็นกลาง จะได้สีชมพูม่วง และสีน้ำเงินขึ้นกับชนิดของโปรตีน
ยกเว้นกรดอะมิโน proline และ hydroxyproline ซึ่งจะให้สีเหลือง
3.
ปฏิกิริยามิลลอน อาศัยหลักว่าโปรตีนที่มี phenolic group อยู่ในโมเลกุล เช่น กรดอะมิโนไทโรซีน เมื่อทำปฏิกิริยากับมิลลอนรีเอเจนต์
(ปรอทในกรดไนตริก) ที่อุณหภูมิสูง จะได้ตะกอนสีขาวในตอนแรกแล้วเปลี่ยนเป็นสีแดงส้ม
4. ปฏิกิริยาแซนโธโพรเธอิค อาศัยหลักการว่าโปรตีนที่มีกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน
ไทโรซีน หรือ
ทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล
เมื่อทำปฏิกิริยากับกรดดินประสิวเข้มข้นจะเกิดสีเหลือง
และถ้าทำปฏิกิริยากับด่างสีจะเข้มขึ้นจนกลายเป็นสีส้ม
จุดประสงค์
เพื่อศึกษาปฏิกิริยาการเกิดสีของโปรตีนในแบบต่างๆ
ตัวอย่างที่ใช้ทดสอบ
1. สารละลายไข่ขาวเจือจาง
2. สารละลายเปปโตน
1%
3. สารละลายไกลซีน
1%
4. สารละลายไทโรซีน
1%
5. เจลาติน
6. นม
7. น้ำตาล
8. ขนมปัง
9. แป้ง
อุปกรณ์และเครื่องมือ
1. หลอดทดลอง
5. pH-paper
2. ปิเปต 5 ml
6. Stirring rod
3. Test tube
rack 7. Watch glass
4. Water
bath 8. บีกเกอร์ 500 ml
สารเคมี
1. 33%
NaOH
2. 1% CuSO4
3. สารละลายนินไฮดริน
:
เตรียมโดยละลายนินไฮดริน 0.2 กรัม
ในเอธิลแอลกอฮอล์ 100 ml
4. มิลลอนรีเอเจนต์
:
เตรียมโดยละลายเมอร์คิวริกซัลเฟต 15 กรัมในกรดกำมะถัน
3 M 100 ml
5. กรดไนตริกเข้มข้น
วิธีการทดลอง
1. ปฏิกิริยาไบยูเรต
ใส่สารที่ต้องการทดสอบ 3 ml
ลงในหลอดทอง
(สำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็งให้ใส่ตัวอย่างในหลอดทดลอง แล้วเติมน้ำกลั่นลงไป 5
ml) เติม 33% NaOH 3ml จากนั้นค่อยๆหยดสารละลาย
1% CuSO4 ลงไปจนเกิดสี
2. ปฏิกิริยานินไฮดริน
ใส่สารที่ต้องการทดสอบ
3
ml ลงในหลอดทอง
(สำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็งให้ใส่ตัวอย่างในหลอดทดลอง แล้วเติมน้ำกลั่นลงไป 5
ml) เตรียมสารละลายนินไฮดรินที่เตรียมใหม่ๆลงไป 1 ml เขย่าให้เข้ากัน ต้มในอ่างน้ำเดือดประมาณ 1 นาที
ปล่อยให้เย็น สังเกตการณ์เปลี่ยนแปลง
3. ปฏิกิริยามิลลอน
ใส่สารที่ต้องการทดสอบ 3 ml
ลงในหลอดทอง
(สำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็งให้ใส่ตัวอย่างในหลอดทดลอง แล้วเติมน้ำกลั่นลงไป 5
ml) เติมมิลลอนรีเอเจนต์ 5 หยด
นำไปอุ่นในอ่างน้ำร้อน สังเกตการเปลี่ยนแปลง
4. ปฏิกิริยาแซนโธโพรเธอิค
ใส่สารที่ต้องการทดสอบ 3 ml
ลงในหลอดทอง
(สำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็งให้ใส่ตัวอย่างในหลอดทดลอง แล้วเติมน้ำกลั่นลงไป 5
ml) เติมกรดไนตริกเข้มข้นลงไป3 ml นำไปอุ่นในอ่างน้ำเดือด
2-3 นาที แล้วทิ้งให้สารละลายเย็นลงอย่างช้าๆ จากนั้นเติม 33%
NaOH ลงไปจนสารละลายเป็นกลาง สังเกตการเปลี่ยนแปลง
ตารางบันทึกผลการทดลอง
สารตัวอย่าง
|
ปฏิกิริยาที่ใช้ทดสอบ
|
ไบยูเรต
|
นินไฮดริน
|
มิลลอน
|
แซนโธโพรเธอิค
|
สารละลายไข่ขาวเจือจาง
|
ม่วงชมพู
|
น้ำเงิน
|
ตะกอนขาวขุ่น
|
เหลืองอ่อน
|
สารละลายเปปโตน 1%
|
ม่วง
|
ม่วงน้ำเงิน
|
เหลืองอ่อน
|
เหลืองขุ่น
|
สารละลายไกลซีน 1%
|
ม่วงน้ำเงิน
|
น้ำเงินเข้ม
|
ใสไม่มีสี
|
ใสไม่มีสี
|
สารละลายไทโรซีน 1%
|
ม่วง
|
ม่วง
|
ตะกอนขาวขุ่น
|
เหลืองอมส้ม
|
เจลาติน
|
ม่วงชมพู
|
ม่วงอ่อน
|
เหลืองส้ม
|
เหลืองอ่อน
|
นม
|
ม่วง
|
ม่วงอ่อน
|
ตะกอนขาวขุ่น
|
สีส้ม
|
น้ำตาล
|
ฟ้าอ่อน
|
ใสไม่มีสี
|
ใสไม่มีสี
|
ใสไม่มีสี
|
ขนมปัง
|
ม่วง
|
ม่วงอ่อนมาก
|
เหลืองส้มขุ่น
|
เหลืองมีตะกอนสีส้ม
|
แป้ง
|
ม่วง
|
ขุ่นมีตะกอน
|
ขาวขุ่นมีตะกอน
|
เหลืองมีตะกอนสีส้ม
|
สรุปวิจารณ์ผลการทดลอง
Ø สารละลายไข่ขาวเจือจาง
ให้ผล negative กับปฎิกิริยา มิลลอน นั่นคือ สารละลายไข่ขาวเจือจาง ไม่มีกรดอะมิโนไทโรซีน อยู่ในโมเลกุล
Ø สารละลายเปปโตน
1%
ให้ผล positive กับทุกปฎิกิริยา นั่นคือ สารละลายเปปโตน 1% เป็นโปรตีน ที่มีหมู่อะมิโนอิสระ
และมีกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน หรือทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล
Ø สารละลายไกลซีน
1% ให้ผล negative กับปฎิกิริยามิลลอน และ ปฏิกิริยาแซนโธโพรเธอิค นั่นคือสารละลายไกลซีน
1% ไม่มีกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน
หรือทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล
Ø สารละลายไทโรซีน
1% ให้ผล negative กับปฎิกิริยา มิลลอน นั่นคือ สารละลายไทโรซีน
1% ไม่มี กรดอะมิโนไทโรซีน
อยู่ในโมเลกุล
Ø เจลาติน
ให้ผล positive
กับทุกปฎิกิริยา นั่นคือ เจลาติน เป็นโปรตีน ที่มีหมู่อะมิโนอิสระ
และมีกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน หรือทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล
Ø นม
ให้ผล negative กับปฎิกิริยา มิลลอน นั่นคือ นมไม่มี
กรดอะมิโนไทโรซีน อยู่ในโมเลกุล
Ø น้ำตาล
ให้ผล negative กับทุกปฎิกิริยา เนื่องจากน้ำตาลไม่มีพันธะเปปไทด์ เพราะน้ำตาลเป็นคาร์โบไฮเดรต
Ø ขนมปัง
ให้ผล positive
กับทุกปฎิกิริยา นั่นคือ ขนมปังมีโปรตีนที่มีหมู่อะมิโนอิสระ และมี กรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน
หรือทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล
Ø แป้ง
ให้ผล negative
กับปฎิกิริยามิลลอน และ ปฏิกิริยานินไฮดริน นั่นคือ แป้งไม่มีกรดอะมิโน ไทโรซีนและโปรตีนที่มีหมู่อะมิโนอิสระ อยู่ในโมเลกุล