ปฏิกิริยาการเกิดสีของโปรตีน

บทนำ

       การทดสอบคุณสมบัติของโปรตีน สามารถทำได้โดยดูปฏิกิริยาการเกิดสีของโปรตีนกับรีเอเจนต์ชนิดต่างๆ ซึ่งโปรตีนแต่ละชนิดอาจให้สีหรือไม่ให้สีกับรีเอเจนต์ที่ใช้ทดสอบ ทั้งนี้ขึ้นกับหมู่เฉพาะที่อยู่ในโปรตีนชนิดนั้นๆ ปฏิกิริยาการให้สีของโปรตีนมีอยู่หลายปฏิกิริยาที่สำคัญด้วยกันคือ

   1.       ปฏิกิริยาไบยูเรต  อาศัยหลักว่าสารที่ประกอบด้วยพันธะเปปไทด์ตั้งแต่สองแห่งขึ้นไป เมื่อทำปฏิกิริยากับไบยูเรตรีเอเจนต์ (สารละลายทองแดงซัลเฟตในด่าง) จะให้สีม่วงจนถึงสีชมพูขึ้นกับขนาดของโมเลกุลของโปรตีน ทั้งนี้เปปไทด์ที่มีโมเลกุลเล็กๆและกรดอะมิโนจะไม่ให้สี

   2.       ปฏิกิริยานินไฮดริน  เป็นปฏิกิริยาการทดสอบโปรตีน และกรดอะมิโนที่มีอย่างน้อย 1 free amine group และ 1 free COOH ในสารละลายที่เป็นกลาง จะได้สีชมพูม่วง และสีน้ำเงินขึ้นกับชนิดของโปรตีน ยกเว้นกรดอะมิโน proline และ hydroxyproline ซึ่งจะให้สีเหลือง

   3.       ปฏิกิริยามิลลอน  อาศัยหลักว่าโปรตีนที่มี phenolic group อยู่ในโมเลกุล เช่น กรดอะมิโนไทโรซีน เมื่อทำปฏิกิริยากับมิลลอนรีเอเจนต์ (ปรอทในกรดไนตริก) ที่อุณหภูมิสูง จะได้ตะกอนสีขาวในตอนแรกแล้วเปลี่ยนเป็นสีแดงส้ม

   4.       ปฏิกิริยาแซนโธโพรเธอิค  อาศัยหลักการว่าโปรตีนที่มีกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน หรือ

ทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล เมื่อทำปฏิกิริยากับกรดดินประสิวเข้มข้นจะเกิดสีเหลือง และถ้าทำปฏิกิริยากับด่างสีจะเข้มขึ้นจนกลายเป็นสีส้ม

จุดประสงค์

       เพื่อศึกษาปฏิกิริยาการเกิดสีของโปรตีนในแบบต่างๆ

ตัวอย่างที่ใช้ทดสอบ

     1.       สารละลายไข่ขาวเจือจาง

     2.       สารละลายเปปโตน 1%

     3.       สารละลายไกลซีน 1%

     4.       สารละลายไทโรซีน 1%

     5.       เจลาติน

     6.       นม

     7.       น้ำตาล

     8.       ขนมปัง

     9.       แป้ง

อุปกรณ์และเครื่องมือ

       1. หลอดทดลอง                 5. pH-paper

       2. ปิเปต 5 ml                      6. Stirring rod

       3. Test tube rack                7. Watch glass

       4. Water bath                     8. บีกเกอร์ 500 ml

สารเคมี

1.       33% NaOH

2.       1% CuSO₄

3.       สารละลายนินไฮดริน : เตรียมโดยละลายนินไฮดริน 0.2 กรัม ในเอธิลแอลกอฮอล์ 100 ml

4.       มิลลอนรีเอเจนต์ : เตรียมโดยละลายเมอร์คิวริกซัลเฟต 15 กรัมในกรดกำมะถัน 3 M 100 ml

5.       กรดไนตริกเข้มข้น

วิธีการทดลอง

1.       ปฏิกิริยาไบยูเรต

       ใส่สารที่ต้องการทดสอบ 3 ml ลงในหลอดทอง (สำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็งให้ใส่ตัวอย่างในหลอดทดลอง แล้วเติมน้ำกลั่นลงไป 5 ml) เติม 33% NaOH 3ml จากนั้นค่อยๆหยดสารละลาย 1% CuSO₄ ลงไปจนเกิดสี 

2.       ปฏิกิริยานินไฮดริน

       ใส่สารที่ต้องการทดสอบ 3 ml ลงในหลอดทอง (สำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็งให้ใส่ตัวอย่างในหลอดทดลอง แล้วเติมน้ำกลั่นลงไป 5 ml) เตรียมสารละลายนินไฮดรินที่เตรียมใหม่ๆลงไป 1 ml เขย่าให้เข้ากัน ต้มในอ่างน้ำเดือดประมาณ 1 นาที ปล่อยให้เย็น สังเกตการณ์เปลี่ยนแปลง

3.       ปฏิกิริยามิลลอน

       ใส่สารที่ต้องการทดสอบ 3 ml ลงในหลอดทอง (สำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็งให้ใส่ตัวอย่างในหลอดทดลอง แล้วเติมน้ำกลั่นลงไป 5 ml) เติมมิลลอนรีเอเจนต์ 5 หยด นำไปอุ่นในอ่างน้ำร้อน สังเกตการเปลี่ยนแปลง

4.       ปฏิกิริยาแซนโธโพรเธอิค

       ใส่สารที่ต้องการทดสอบ 3 ml ลงในหลอดทอง (สำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็งให้ใส่ตัวอย่างในหลอดทดลอง แล้วเติมน้ำกลั่นลงไป 5 ml) เติมกรดไนตริกเข้มข้นลงไป3 ml นำไปอุ่นในอ่างน้ำเดือด 2-3 นาที แล้วทิ้งให้สารละลายเย็นลงอย่างช้าๆ จากนั้นเติม 33% NaOH ลงไปจนสารละลายเป็นกลาง สังเกตการเปลี่ยนแปลง

ตารางบันทึกผลการทดลอง

สารตัวอย่าง	ปฏิกิริยาที่ใช้ทดสอบ
	ไบยูเรต	นินไฮดริน	มิลลอน	แซนโธโพรเธอิค
สารละลายไข่ขาวเจือจาง	ม่วงชมพู	น้ำเงิน	ตะกอนขาวขุ่น	เหลืองอ่อน
สารละลายเปปโตน 1%	ม่วง	ม่วงน้ำเงิน	เหลืองอ่อน	เหลืองขุ่น
สารละลายไกลซีน 1%	ม่วงน้ำเงิน	น้ำเงินเข้ม	ใสไม่มีสี	ใสไม่มีสี
สารละลายไทโรซีน 1%	ม่วง	ม่วง	ตะกอนขาวขุ่น	เหลืองอมส้ม
เจลาติน	ม่วงชมพู	ม่วงอ่อน	เหลืองส้ม	เหลืองอ่อน
นม	ม่วง	ม่วงอ่อน	ตะกอนขาวขุ่น	สีส้ม
น้ำตาล	ฟ้าอ่อน	ใสไม่มีสี	ใสไม่มีสี	ใสไม่มีสี
ขนมปัง	ม่วง	ม่วงอ่อนมาก	เหลืองส้มขุ่น	เหลืองมีตะกอนสีส้ม
แป้ง	ม่วง	ขุ่นมีตะกอน	ขาวขุ่นมีตะกอน	เหลืองมีตะกอนสีส้ม

สรุปวิจารณ์ผลการทดลอง

Ø สารละลายไข่ขาวเจือจาง ให้ผล negative  กับปฎิกิริยา มิลลอน นั่นคือ สารละลายไข่ขาวเจือจาง                 ไม่มีกรดอะมิโนไทโรซีน อยู่ในโมเลกุล

Ø สารละลายเปปโตน 1%  ให้ผล positive กับทุกปฎิกิริยา นั่นคือ สารละลายเปปโตน 1% เป็นโปรตีน ที่มีหมู่อะมิโนอิสระ และมีกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน หรือทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล

Ø สารละลายไกลซีน 1%  ให้ผล negative กับปฎิกิริยามิลลอน และ ปฏิกิริยาแซนโธโพรเธอิค นั่นคือสารละลายไกลซีน 1%   ไม่มีกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน หรือทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล

Ø สารละลายไทโรซีน 1% ให้ผล negative  กับปฎิกิริยา มิลลอน นั่นคือ สารละลายไทโรซีน 1% ไม่มี     กรดอะมิโนไทโรซีน อยู่ในโมเลกุล

Ø เจลาติน ให้ผล positive กับทุกปฎิกิริยา นั่นคือ เจลาติน เป็นโปรตีน ที่มีหมู่อะมิโนอิสระ และมีกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน หรือทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล

Ø นม ให้ผล negative  กับปฎิกิริยา มิลลอน นั่นคือ นมไม่มี กรดอะมิโนไทโรซีน อยู่ในโมเลกุล

Ø น้ำตาล ให้ผล negative กับทุกปฎิกิริยา เนื่องจากน้ำตาลไม่มีพันธะเปปไทด์ เพราะน้ำตาลเป็นคาร์โบไฮเดรต

Ø ขนมปัง ให้ผล positive กับทุกปฎิกิริยา นั่นคือ ขนมปังมีโปรตีนที่มีหมู่อะมิโนอิสระ และมี   กรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน ไทโรซีน หรือทริปโตเฟนอยู่ในโมเลกุล

Ø แป้ง ให้ผล negative กับปฎิกิริยามิลลอน และ ปฏิกิริยานินไฮดริน นั่นคือ แป้งไม่มีกรดอะมิโน    ไทโรซีนและโปรตีนที่มีหมู่อะมิโนอิสระ อยู่ในโมเลกุล